Kontrastverfahren in der Mikroskopie

Bei der normalen mikroskopischen Beobachtung wird ein transparentes Präparat in der Regel im Durchlicht betrachtet. Dieses wird auch als Hellfeldmikroskopie bezeichnet, wenn man es von den folgenden Kontrastverfahren abgrenzen will.

Dunkelfeld

Hier wird durch einen speziellen Kondensor der Strahlengang des Mikroskops so gerichtet, dass das Licht das Präparat schräg durchstrahlt, aber ohne Wechselwirkung mit einem Präparat kein Licht in das Objektiv fällt. Nur dort, wo das Präparat (Zellstrukturen) das Licht beugt, gelangt Licht in das Objektiv. Das Präparat erscheint daher hell vor einem schwarzen Hintergrund. Dunkelfeldkondensoren besitzen entweder eine Zentralblende, die das direkte Licht blockt, oder eine aufwändige optische Konstruktion aus Linsen und verspiegelten Elementen, die als Kardioidkondensor bezeichnet wird.

Je nachdem, welches Objektiv genutzt werden soll, wird ein "trockener" oder ein "Öl" Dunkelfeldkondensor ("Öl" für alle Objektive mit Ölimmersion, in der Regel das 100x Objektiv) benötigt. Möchte man alle Mikroskopobjektive für die Dunkelfeldbeobachtungen nutzen, so müssen beide Kondensoren angeschafft werden. Vielseitiger (und auch für den ungeübten Nutzer einfacher zu justieren) sind "trockene" Dunkelfeldkondensoren, weil damit ein breiterer Vergrößerungsbereich genutzt werden kann. In Verbindung mit einem 60x Objektiv können so auch Vergrößerungen bis etwa 900x realisiert werden. Bei der Ölimmersion muss immer auch der Kondensor immergiert werden, dies gilt übrigens im Hellfeld wie im Dunkelfeld gleichermaßen.

Setting

Dunkelfeld Kondensor trocken

BRESSER Dunkelfeld Kondensor trocken

Dunkelfeld Kondensor (Öl-Typ)

BRESSER Dunkelfeld Kondensor (Öl-Typ)

Typische Anwendungen für die Dunkelfeldmikroskopie

Das Dunkelfeld eignet sich als Kontrastverfahren immer dann besonders, wenn transparente Zellen oder Mikroorganismen sichtbar gemacht werden sollen, die selbst wenig Kontrast haben. Typische Beispiele sind zB Amöben oder Epithelzellen, zB von der Mundschleimhaut. Hier kann dann auf eine Fixierung und anschließene Färbung verzichtet werden. Dunkelfeldmikroskopie eignet sich auch besonders für Lebendkulturen von Wasserorganismen oder Algen, die man ja in Bewegung sehen möchte, was eine Färbung meistens ausschließt. Zusätzlich zum erzielten Kontrastgewinn sind Dunkelfeldbeobachtungen auch ästhetisch besonders reizvoll!

Schiefe Beleuchtung

Bei der schiefen Beleuchtung wird eine Kontrastierung erzielt, indem ein Teil bzw. eine Hälfte des normalen Beleuchtungsstrahlengangs abgedeckt wird. Kommerzielle Lösungen für dieses Kontrastverfahren sind leider selten, man kann diesen Effekt aber mit einer selbst angefertigten Blende / Schieber in der Filterebene des Kondensors erzielen. Oft kann auch ein vorhandener Filterhalter oder eine Hilfslinse am Kondensor teilweise in den Strahlengang eingeschwenkt werden. Der Rahmen des Filterhalters bzw. der Feldlinse blockiert dann einen Teil des Lichts. Das Präparat wird dann schräg durchstrahlt, es ergibt sich quasi ein Schattenwurf an Feinstrukturen des Präparats.

Stentor - schiefe Beleuchtung

Stentor - schiefe Beleuchtung

Stentor Hellfeld

Stentor Hellfeld

Phasenkontrast

Beim Phasenkontrastverfahren wird eine Kombination aus einem speziellen Kondensor mit wechselbaren Blenden (diese erzeugen einen Lichtring) und entsprechenden Phasenkontrastobjektiven (mit Phasenring) verwendet. Das Licht, welches das Präparat durchstrahlt, wird dort gebeugt und erfährt an Bestandteilen mit unterschiedlichem Brechungsindex eine Phasenverschiebung. Licht, welches keine Beugung erfährt, wird am Phasenring geblockt. 

Üblicherweise werden separate Phasenkontrastsätze angeboten. Eine ausschließliche Ausstattung des Mikroskops nur mit Phasenkontrastobjektiven ist in der Regel nicht empfehlenswert, weil zwar die Auflösung der Objektive durch den Phasenring nicht beeinträchtigt wird, der Kontrast aber schlechter ist als bei normalen Hellfeldobjektiven. Auch für Polarisation eignen sich diese Objektive nicht. 

Ein Phasenkontrastkondensor muss sorgfältig zentriert werden, damit Lichtring und Phasenring aufeinander abgebildet werden. Daher ist ein Wechsel zwischen Phasenkontrastkondensor und Hell-oder Dunkelfeldkondensor aufwändig. Man kann aber einzelne Hellfeldobjektive im Revolver neben mit Phasenobjektiven verwenden, denn der Phasenkontrastkondensor hat einen Durchlass für Hellfeld. Für die Zentrierung bzw. die Höheneinstellung des Kondensors ist im Phasenkontrastsatz ein Hilfsokular (auch "Einstellfernrohr" genannt) enthalten, so dass auf die Ebenen von Phasen- und Lichtring scharfgestellt werden kann.

Die Bedingungen für Phasenkontrast sind optimal nur für grünes Licht erfüllt. Daher ist ein entsprechendes Grünfilter hilfreich. Da ohnehin farblose Objekte im Phasenkontrast beobachtet werden, ist eine Einfärbung des Bildes tolerierbar.

Setting

Phasenkonstrast

BRESSER Science IVM-401 Phasenkonstrast Set

Phasenkontrastsatz

BRESSER Phasenkontrastsatz (für Science)

Typische Anwendungen für Phasenkontrast

Ähnlich wie beim Dunkelfeld eignet sich Phasenkontrast für Objekte, die farblos sind und wenig Kontrast haben. Darunter fallen z.B. Planktonorganismen oder Belebtschlamm. Auch Zellkulturen oder Zellen im Urinsediment können mit Phasenkontrast besser dargestellt und damit auch schneller und sicherer beurteilt werden als im Hellfeld. Auch die Zählung von Asbestfasern erfolgt bei einigen Standardprotokollen im Phasenkontrast.

Polarisation

Durch Polarisation können optisch aktive  bzw. doppelbrechende Präparatstrukturen besonders hervorgehoben werden. Das können zB Minerale sein, aber auch viele Kunststoffe, Naturstoffe wie Stärke etc. zeigen diesen Effekt. Weniger bekannt ist, dass man zB auch an lebenden Organismen interessante Strukturen hervorheben kann, so zB Muskelfasern von Daphnien oder Rädertierchen. Die Polarisation dient in der Industrie vor allem zur Charakterisierung von Materialien. Ist die Schichtdicke eines Materials bekannt, so kann anhand der entstehenden Interferenzfarben auch auf das Material geschlossen werden. In der Materialforschung wird die Polarisation zB auch zur Untersuchung von Spannungen im Material durch Spannungsdoppelbrechung genutzt. Besonders Spritzgussteile oder Kunststofffolien bzw. Fasern können so auf Herstellungsfehler untersucht werden. Die klassische Anwendung ist natürlich die Geologie / Mineralogie, bei der Gesteinsdünnschliffe in polarisiertem Licht untersucht werden.

Aufgrund der Spektralverteilung sind in der Polarisationsmikroskopie Halogenbeleuchtungen besser geeignet als LED.

Setting

BRESSER Science MPO 401 Mikroskop

BRESSER Science MPO 401 Mikroskop

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